De 1363 à 1667, Kiev fait partie de l’Union de Pologne-Lituanie, qui devient, par l’Union de Lublin en 1569, la République des Deux Nations. À la fin du XVe siècle, Kiev adopte le droit de Magdebourg. Après l’union de Brest (1596), Kiev devient l’un des lieux majeurs de l’affrontement entre uniates et orthodoxes. Suite à la révolte des Cosaques de 1648, le hetman Bogdan Khmelnitski fait une entrée triomphante dans Kiev. Il cherche à établir un État ukrainien indépendant, l’Hetmanat cosaque. Cependant, la guerre avec la puissante armée polonaise devient très difficile, et Khmelnitski se tourne vers une alliance avec le tsar de Moscovie. Par le traité d’Androusovo de 1667, Kiev fait partie des territoires ukrainiens placés sous le protectorat de Moscou. Ces territoires seront incorporés par la suite dans l’Empire russe. L’Hetmanat cosaque disparaît officiellement sous le règne de la tsarine Catherine II. Au XIXe siècle, Kiev prit un certain essor grâce au développement du chemin de fer.